常见细胞分离液的操作方法

1、Ficoll

   最经典的外周血单个核细胞分离液，能将淋巴细胞、单核细胞与红细胞、粒细胞分开。不通过红细胞沉降，可避免粒细胞混入。

   是可以分离特定密度细胞的分离液（1.077, 1.084 和 1.073 g/mL 三款），适于已知密度细胞的分离。

2、Percoll

   由聚乙/烯吡/咯烷酮包被的硅胶颗粒组成，可以形成连续或不连续的密度梯度，适合分离密度相近的细胞亚群，如NK细胞、树突状细胞等。

    可分为Percoll和Percoll PLUS，Percoll是PVP涂层硅胶介质，Percoll PLUS是共价偶联烷硅涂层硅胶介质，性质更加稳定。

    Percoll PLUS内毒素含量较低（<2EU/ml），有法规文件（RSF 文件）支持，可以用于临床研究，Percoll 仅能用于科研。

01、不同浓度分离液的制备:

先用9份分离液与1份8.5％ NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液稀释到所需浓度。

02、不连续密度梯度层的制备:

先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。

在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层比重相差不大时，可将液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。

03、装样：

样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

04、离心：

一般采用离心力为400g，时间20～25min。

由于多层之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

05、取样：

当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于层中,则需要逐层收集。收获含有液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。