试剂盒工作原理

本试剂盒采用的是生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中小鼠肿瘤坏死因子α水平。

向预先包被了小鼠肿瘤坏死因子α单克隆抗体的酶标孔中加入小鼠肿瘤坏死因子α，温育；温育后，加入生物素标记的抗小鼠肿瘤坏死因子α抗体。

再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅与样品中小鼠肿瘤坏死因子α的浓度呈正相关。
 

实验操作步骤

1. 从室温平衡30min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.加样：

1）空白孔，空白对照孔只加显色剂A&B和终止液。其余各步操作相同；

2）标准品孔：加入标准品50ul，链霉亲和素-HRP50ul；

3）待测样品孔：加入样本40ul，然后各加入抗体10ul、链霉亲和素-HRP50ul；

3.盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

4. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置30秒，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

5. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

6. 每孔加入终止液50μL，10min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

7.根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。