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细胞转染的原理、操作步骤
人阅读 发布时间：2023-05-08 08:45
细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤。
脂质体(Liposome)转染方法原理：
脂质体作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 优点:与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性，它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。
脂质体转染操作步骤
(1)细胞培养：取6cm细胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃ CO2培养密度至40%~60%，密度过大，转染后不利筛选细胞。
(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1ug 质粒DNA。 B液：用不含血清培养基稀释2ul脂质体。 分别将A液与B液轻弹混匀，静置5分钟。
(3)吸取B液加入至A液中，轻弹混匀。室温中置10-15分钟。
(4)转染准备：用1mL不含血清培养液漂洗两次，再加入4mL不含血清培养液。
(5)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
(6)瞬时转染后，可在48h-72h细胞长满之后，提取细胞蛋白或者RNA，验证敲减/过表达效率。
脂质体(Liposome)转染方法原理：
脂质体作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 优点:与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性，它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。
脂质体转染操作步骤
(1)细胞培养：取6cm细胞皿，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃ CO2培养密度至40%~60%，密度过大，转染后不利筛选细胞。
(2) 转染液制备：在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1ug 质粒DNA。 B液：用不含血清培养基稀释2ul脂质体。 分别将A液与B液轻弹混匀，静置5分钟。
(3)吸取B液加入至A液中，轻弹混匀。室温中置10-15分钟。
(4)转染准备：用1mL不含血清培养液漂洗两次，再加入4mL不含血清培养液。
(5)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
(6)瞬时转染后，可在48h-72h细胞长满之后，提取细胞蛋白或者RNA，验证敲减/过表达效率。
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