RNA 提取操作步骤与注意事项

操作步骤:

1. 匀浆处理:a. 组织 将组织在液氮中磨碎, 每 50-100 mg 组织加入 1 ml TRIzol, 用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过 TRIzol 体积 10℅。

b. 单层培养细胞 直接在培养板中加入 TRIzol 裂解细胞，每 10 cm2 面积 (即 3.5 cm 直径的培养板) 加 1 ml，用移液器吸打几次。TRIzol 的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol 加量不足可能导致提取的 RNA 有 DNA 污染。

c．细胞悬液 离心收集细胞，每 5-10×106 动物、植物、酵母细胞或 1×107 细菌细胞加入 1 ml TRIzol，反复吸打。加 TRIzol 之前不要洗涤细胞以免 mRNA 降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置 5 分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于 2-8℃10000×g 离心 10 分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量 DNA，上清中含有 RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4. 每使用 1 ml TRIzol 加入 0.2 mllu 仿，剧烈振荡 15 秒，室温放置 3 分钟。

5. 2-8℃10000×g 离心 15 分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA 主要在水相中，水相体积约为所用 TRIzol 试剂的 60℅。

6. 把水相转移到新管中，如要分离 DNA 和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的 RNA。每使用 1 ml TRIzol 加入 0.5 ml 异丙醇，室温放置 10 分钟。

7. 2-8℃10000×g 离心 10 分钟，离心前看不出 RNA 沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

8. 用 75℅乙醇洗涤 RNA 沉淀。每使用 1 ml TRIzol 至少加 1 ml 75℅乙醇。2-8℃ 不超过 7500×g 离心 5 分钟，弃上清。

9. 室温放置干燥或真空抽干 RNA 沉淀，大约晾 5-10 分钟即可. 不要真空离心干燥，过于干燥会导致 RNA 的溶解性大大降低。加入 25-200μl 无 RNase 的水或 0.5℅SDS, 用枪头吸打几次,55-60℃ 放置 10 分钟使 RNA 溶解。如 RNA 用于酶切反应, 勿使用 SDS 溶液。RNA 也可用 100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃ 保存。

注意事项：

1. 从少量样品（1-10 mg 组织或 102-104 细胞）中提取 RNA 时可加入少许糖原以促进 RNA 沉淀。例如加 800 ml TRIzol 匀浆样品，沉淀 RNA 前加 5-10 μg RNase-free 糖原。糖原会与 RNA 一同沉淀出来，糖原浓度不高于 4 mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响 PCR 反应。

2．匀浆后加 lu 仿之前样品可以在-60 至-70℃ 保存至少一个月。RNA 沉淀可以保存于 75% 酒精中 2-8℃ 一星期以上或-5 至-20℃ 一年以上。

3．分层和 RNA 沉淀时也可使用台式离心机，2600×g 离心 30-60 分钟。